李新揚 博士
台北榮總婦產科生殖內分泌科主治醫生
中華民國生育醫學會秘書長
前言
科學的進步早已讓人類克服許多限制，包括二度空間的穿越：地球上任意兩點都可以在48小時內到達；三度空間的突破：人類漫遊外太空及登陸月球。然而對於時間，第四個象限的限制，仍是一籌莫展，人類自己無法隨意回到過去及未來，也無法凍結時間。
隨著人工生殖技術的進步，我們已能成功冷凍著床前的胚胎、精子及卵子，讓它們在零下150度更低的液態氮環境中，降低甚至暫停細胞代謝，如此可以停留上百年的時間，需要時才行解凍，繼續生命的進展。卵子的冷凍比著床前胚胎及精子的冷凍困難許多，主要是因為卵子細胞較大且水分較多，在冷凍過程中不易脫水，而且成熟卵子的紡綞體也容易受到冷凍傷害。
在自然界也發現有此現象，例如北極蛙可以在零下8℃ 存活兩週以上，最主要是靠在低溫時產生大量的葡萄糖及甘油，此兩種物質是冷凍保護劑，可以避免細胞內形成冰晶。卵子的冷凍方式最早是採用慢速冷凍法，雖然解凍後的成功懷孕率有逐漸改善，但是仍不夠理想。最近幾年改用快速冷凍法，卵子解凍的存活率、受精率及懷孕率均較慢速冷凍法來得高。因此值得我們介紹給罹癌且未婚的生育年齡婦女，讓她們在接受放射或化學治療前，能以最佳的方式來保留生育能力。
玻璃化冷凍法
快速冷凍法又稱為玻璃化冷凍法，是指藉由快速降低溫度及增加黏稠度的方式將液體物質固體化成為一種「非結晶的玻璃態」。
生物細胞最主要組成分子是水分子，當溫度降低到0℃以下，在一般情況下水分子會形成結晶態的冰晶，而這些冰晶會壓迫細胞內的胞器，進而對細胞造成傷害。在一些特定條件的配合下，細胞在溫度降低的過程中不會形成冰晶，而是變成玻璃化的狀態，其中最重要的三個條件為：溫度的降低速度要快、使用較高劑量的冷凍保護劑，即增加黏稠度、及存放細胞的標本體積要小。當溫度降低到生物標本的「玻璃轉化溫度」(約在零下120℃附近)之下時，標本就不再形成冰晶而達到一個穩定狀態，因此當溫度降低到「玻璃轉化溫度」的速度夠快時，可以儘量減少冰晶的產生。其次，冷凍保護劑可以和細胞內的水分子形成氫鍵，進而避免再溫度下降過程中冰晶的形成。此外，存放細胞的標本體積越小，溫度降低所需要釋放的能量越少，因此能夠越有效率的快速降低標本溫度。玻璃化冷凍法的操作是將生物標本置入含有高濃度冷凍保護劑的培養液中，在幾秒的極短時間內將標本直接置入液態氮筒中，最後降溫至零下150℃以下；置入液態氮後標本的降溫速率高達每分鐘1500℃，若裝置液態氮的容器有抽真空裝置，則其降溫速率可再提高為每分鐘10000℃，如此快的降溫速度可以將冷凍過程對細胞的傷害降至最低，這些傷害包括高濃度冷凍保護劑的細胞毒性、降溫至接近0℃時對胞膜的傷害及上述細胞內冰晶的傷害。解凍過程則將標本置於37℃三秒中，然後將冷凍保護劑的濃度逐漸降低，最後再移入不含冷凍保護劑的培養液中。
現況
Kuleshova等學者於1999年發表第一例玻璃化冷凍人類卵子解凍後成功懷孕的案例，他們使用的冷凍保護劑是40%乙二醇及0.6M蔗糖，而採用的存放卵子標本器材為開放式麥管。玻璃化冷凍人類卵子的第一個大型研究是Yoon等學者於2003年發表，總共冷凍保存了474個卵子，所使用的冷凍保護劑5.5M乙二醇及1.0M蔗糖，而為了增加冷凍速率，他們將卵子標本放在電子顯微鏡所使用的格架上；結果發現冷凍卵子解凍後的存活率為68.7%，解凍後存活卵子受精率為71.7%，每次胚胎植入後懷孕且活產率為21.4%。Chian等人於2005年發表的玻璃化冷凍人類卵子的成功率更高，解凍後的存活率為93.9%，受精率為74.6%，懷孕率則為46.7%，他們使用的冷凍保護劑是乙二醇、丙二醇及蔗糖。Kuwayama等人也於2005年發表的結果也甚佳，解凍後的存活率為90.8%，受精率為89.6%，懷孕率則為41.4%，所使用的冷凍保護劑是乙二醇及蔗糖，而採用的存放卵子標本器材則為開放式的Cryotop。除了上述的器材之外，另外還有一種稱為Cryoloop的器材，將卵子置於一層冷凍培養液薄膜中，好處是液體體積小而接觸表面積大，可將降溫速率最大化。不論是電顯格架、Cryotop、或Cryoloop都屬於開放系統，也就是卵子標本會和液態氮直接接觸，最近有一種密閉系統器材發展出來，稱為Cryotip，應用在卵子冷凍的成果和開放系統一樣好。
安全性
上述玻璃化冷凍卵子的存放器材大多屬於開放系統，標本會直接和液態氮接觸，好處是標本降溫速度快，潛在的風險是液態氮可能散播傳染病。為探討此一可能，有研究將三種牛體病毒污染液態氮後，再將存置於開放式或密閉式器材的玻璃化冷凍牛胚放進上述遭污染之液態氮中，結果發現存置於開放式器材的牛胚有21.3%遭到病毒感染，然而存置於密閉式器材的牛胚則無任何病毒感染。在密閉式玻璃化冷凍卵子器材尚未發展出來之前，因為有上述的微生物感染的風險，使得人工生殖技術專家們裹足不前，不願意嘗試用成功率較高的玻璃化冷凍法來保存卵子，而繼續使用傳統的慢速冷凍法；現在，密閉式玻璃化冷凍卵子器材Cryotip發展出來後，可以避免微生物感染的風險，相信未來會有越來越多人工生殖醫療機構願意採用玻璃化冷凍法來保存卵子，來提高冷凍卵子解凍後的存活率、受精率與懷孕率。
結論
隨著人工生殖技術的進步，冷凍卵子的成功率有大幅的提升，這項技術已從實驗性質邁向臨床應用階段，而玻璃化冷凍卵子法比傳統的慢速冷凍法的成功率更高；密閉式玻璃化冷凍卵子器材已發展出來，其成功率和早期使用的開放式玻璃化冷凍卵子器材一樣好，好處是可以避免微生物感染的風險。現在玻璃化冷凍卵子技術可以應用於罹癌婦女，在接受放射或化學治療前保留其生育能力，協助他們完成孕育下一代的美夢。
名詞中英對照
玻璃化冷凍法 vitrification
甘油 glycerin
葡萄糖 glucosamine
參考資料
1.Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the cryotop method. Theriogenology 67, 73-80 (2007).
2.Yavin, S. & Arav, A. Measurement of essential physical properties of vitrification solitions. Theriogeology 67, 81-9 (2007).
3.Jack R. Layne, J., Richard E. Lee, Jr. Adaptations of frogs to survive freezing. Climate Research 5, 53-59 (1995).
4.Kuleshova, L., Gianaroli, L., Magli, C., Ferraretti, A. & Trounson, A. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report. Hum Reprod 14, 3077-9 (1999).
5.Yoon, T. K. et al. live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 79, 1323-6 (2003).
6.Chian RC, S. W., Huang JY, Cui SJ, bucket WM, Tan SL. High survival rates and pregnancies of human oocytes following vitrification: pre;iminary report. Fertil Steril 84(Suppl 1), S36 (2005).
7.Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O. & Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online 11, 300-8 (2005).
8.Jain, J. K. & Paulson, R. J. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril 86 suppl 4, 1037-46 (2006).
9.Bielanski, A., Nadin-Davis, S., Sapp, T. & Lutze- Wallace, C. Viral contamination of embryos cryopresered in liquid nitrogen. Cryobiology 40, 110-6 (2000).
上一個 回列表
下一個
台北榮總婦產科生殖內分泌科主治醫生
中華民國生育醫學會秘書長
前言
科學的進步早已讓人類克服許多限制，包括二度空間的穿越：地球上任意兩點都可以在48小時內到達；三度空間的突破：人類漫遊外太空及登陸月球。然而對於時間，第四個象限的限制，仍是一籌莫展，人類自己無法隨意回到過去及未來，也無法凍結時間。
隨著人工生殖技術的進步，我們已能成功冷凍著床前的胚胎、精子及卵子，讓它們在零下150度更低的液態氮環境中，降低甚至暫停細胞代謝，如此可以停留上百年的時間，需要時才行解凍，繼續生命的進展。卵子的冷凍比著床前胚胎及精子的冷凍困難許多，主要是因為卵子細胞較大且水分較多，在冷凍過程中不易脫水，而且成熟卵子的紡綞體也容易受到冷凍傷害。
在自然界也發現有此現象，例如北極蛙可以在零下8℃ 存活兩週以上，最主要是靠在低溫時產生大量的葡萄糖及甘油，此兩種物質是冷凍保護劑，可以避免細胞內形成冰晶。卵子的冷凍方式最早是採用慢速冷凍法，雖然解凍後的成功懷孕率有逐漸改善，但是仍不夠理想。最近幾年改用快速冷凍法，卵子解凍的存活率、受精率及懷孕率均較慢速冷凍法來得高。因此值得我們介紹給罹癌且未婚的生育年齡婦女，讓她們在接受放射或化學治療前，能以最佳的方式來保留生育能力。
玻璃化冷凍法
快速冷凍法又稱為玻璃化冷凍法，是指藉由快速降低溫度及增加黏稠度的方式將液體物質固體化成為一種「非結晶的玻璃態」。
生物細胞最主要組成分子是水分子，當溫度降低到0℃以下，在一般情況下水分子會形成結晶態的冰晶，而這些冰晶會壓迫細胞內的胞器，進而對細胞造成傷害。在一些特定條件的配合下，細胞在溫度降低的過程中不會形成冰晶，而是變成玻璃化的狀態，其中最重要的三個條件為：溫度的降低速度要快、使用較高劑量的冷凍保護劑，即增加黏稠度、及存放細胞的標本體積要小。當溫度降低到生物標本的「玻璃轉化溫度」(約在零下120℃附近)之下時，標本就不再形成冰晶而達到一個穩定狀態，因此當溫度降低到「玻璃轉化溫度」的速度夠快時，可以儘量減少冰晶的產生。其次，冷凍保護劑可以和細胞內的水分子形成氫鍵，進而避免再溫度下降過程中冰晶的形成。此外，存放細胞的標本體積越小，溫度降低所需要釋放的能量越少，因此能夠越有效率的快速降低標本溫度。玻璃化冷凍法的操作是將生物標本置入含有高濃度冷凍保護劑的培養液中，在幾秒的極短時間內將標本直接置入液態氮筒中，最後降溫至零下150℃以下；置入液態氮後標本的降溫速率高達每分鐘1500℃，若裝置液態氮的容器有抽真空裝置，則其降溫速率可再提高為每分鐘10000℃，如此快的降溫速度可以將冷凍過程對細胞的傷害降至最低，這些傷害包括高濃度冷凍保護劑的細胞毒性、降溫至接近0℃時對胞膜的傷害及上述細胞內冰晶的傷害。解凍過程則將標本置於37℃三秒中，然後將冷凍保護劑的濃度逐漸降低，最後再移入不含冷凍保護劑的培養液中。
現況
Kuleshova等學者於1999年發表第一例玻璃化冷凍人類卵子解凍後成功懷孕的案例，他們使用的冷凍保護劑是40%乙二醇及0.6M蔗糖，而採用的存放卵子標本器材為開放式麥管。玻璃化冷凍人類卵子的第一個大型研究是Yoon等學者於2003年發表，總共冷凍保存了474個卵子，所使用的冷凍保護劑5.5M乙二醇及1.0M蔗糖，而為了增加冷凍速率，他們將卵子標本放在電子顯微鏡所使用的格架上；結果發現冷凍卵子解凍後的存活率為68.7%，解凍後存活卵子受精率為71.7%，每次胚胎植入後懷孕且活產率為21.4%。Chian等人於2005年發表的玻璃化冷凍人類卵子的成功率更高，解凍後的存活率為93.9%，受精率為74.6%，懷孕率則為46.7%，他們使用的冷凍保護劑是乙二醇、丙二醇及蔗糖。Kuwayama等人也於2005年發表的結果也甚佳，解凍後的存活率為90.8%，受精率為89.6%，懷孕率則為41.4%，所使用的冷凍保護劑是乙二醇及蔗糖，而採用的存放卵子標本器材則為開放式的Cryotop。除了上述的器材之外，另外還有一種稱為Cryoloop的器材，將卵子置於一層冷凍培養液薄膜中，好處是液體體積小而接觸表面積大，可將降溫速率最大化。不論是電顯格架、Cryotop、或Cryoloop都屬於開放系統，也就是卵子標本會和液態氮直接接觸，最近有一種密閉系統器材發展出來，稱為Cryotip，應用在卵子冷凍的成果和開放系統一樣好。
安全性
上述玻璃化冷凍卵子的存放器材大多屬於開放系統，標本會直接和液態氮接觸，好處是標本降溫速度快，潛在的風險是液態氮可能散播傳染病。為探討此一可能，有研究將三種牛體病毒污染液態氮後，再將存置於開放式或密閉式器材的玻璃化冷凍牛胚放進上述遭污染之液態氮中，結果發現存置於開放式器材的牛胚有21.3%遭到病毒感染，然而存置於密閉式器材的牛胚則無任何病毒感染。在密閉式玻璃化冷凍卵子器材尚未發展出來之前，因為有上述的微生物感染的風險，使得人工生殖技術專家們裹足不前，不願意嘗試用成功率較高的玻璃化冷凍法來保存卵子，而繼續使用傳統的慢速冷凍法；現在，密閉式玻璃化冷凍卵子器材Cryotip發展出來後，可以避免微生物感染的風險，相信未來會有越來越多人工生殖醫療機構願意採用玻璃化冷凍法來保存卵子，來提高冷凍卵子解凍後的存活率、受精率與懷孕率。
結論
隨著人工生殖技術的進步，冷凍卵子的成功率有大幅的提升，這項技術已從實驗性質邁向臨床應用階段，而玻璃化冷凍卵子法比傳統的慢速冷凍法的成功率更高；密閉式玻璃化冷凍卵子器材已發展出來，其成功率和早期使用的開放式玻璃化冷凍卵子器材一樣好，好處是可以避免微生物感染的風險。現在玻璃化冷凍卵子技術可以應用於罹癌婦女，在接受放射或化學治療前保留其生育能力，協助他們完成孕育下一代的美夢。
名詞中英對照
玻璃化冷凍法 vitrification
甘油 glycerin
葡萄糖 glucosamine
參考資料
1.Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the cryotop method. Theriogenology 67, 73-80 (2007).
2.Yavin, S. & Arav, A. Measurement of essential physical properties of vitrification solitions. Theriogeology 67, 81-9 (2007).
3.Jack R. Layne, J., Richard E. Lee, Jr. Adaptations of frogs to survive freezing. Climate Research 5, 53-59 (1995).
4.Kuleshova, L., Gianaroli, L., Magli, C., Ferraretti, A. & Trounson, A. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report. Hum Reprod 14, 3077-9 (1999).
5.Yoon, T. K. et al. live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 79, 1323-6 (2003).
6.Chian RC, S. W., Huang JY, Cui SJ, bucket WM, Tan SL. High survival rates and pregnancies of human oocytes following vitrification: pre;iminary report. Fertil Steril 84(Suppl 1), S36 (2005).
7.Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O. & Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online 11, 300-8 (2005).
8.Jain, J. K. & Paulson, R. J. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril 86 suppl 4, 1037-46 (2006).
9.Bielanski, A., Nadin-Davis, S., Sapp, T. & Lutze- Wallace, C. Viral contamination of embryos cryopresered in liquid nitrogen. Cryobiology 40, 110-6 (2000).